PROJETS DE RECHERCHE REALISE

 

Evaluation in vivo de la fonction des ilots de Langerhans humains chez la souris immuno incompetente

Expression du facteur tissulaire par les cellules exocrines pancréatiques humaines dédifférenciées

Thérapie cellulaire du diabète : évaluation in vivo de la sécrétion d'insuline après autogreffe d'îlots chez le porc pancreatectomisé

Mécanismes de prolifération/différenciation des cellules b humaines

Dysfonctionnement des cellules beta au cours du diabète de type 2 : rôle de la glucotoxicité et de la lipotoxicité et inffluence du Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma

Etude de l'activation de la coagulation majeure après injection intraportale d'îlots de Langerhans

Transdifférenciation in vitro du tissu pancréatique exocrine humain

Viabilité et fonctionnalité des cellules beta après isolement

 


Evaluation in vivo de la fonction des ilots de langerhans humains chez la souris immuno incompetente (DEA 2005)

La restauration d'une sécrétion endogène d'insuline par la thérapie cellulaire représente un traitement d'avenir du diabète de type 1. L'absence d'une technique fiable et reproductible de quantification de la qualité des préparations greffées reste encore un frein à son optimisation. Le but de notre étude était d'une part la mise au point d'un modèle d'évaluation in vivo de la fonction des îlots par transplantation sous la capsule rénale d'une souris immuno-incompétente et d'autre part la validation de ce modèle par comparaison des résultats chez la souris avec les résultats chez le patient diabétique greffé. Enfin nous avons utilisé ce modèle pour tenter d'optimiser la fonction des îlots greffés en utilisant les propriétés de mobilisation des cellules endothéliales de la Simvastatine (HMG CoA Reductase). Matériel et méthodes : Afin de mettre au point notre modèle, nous avons constitué 4 groupes de souris immuno-incompétentes recevant un nombre croissant d'îlots équivalents (IEQ) transplantés (500, 1000, 2000 et 3000 IEQ). Le sang des souris était prélevé à J0, J15, J30, J45, J60 et J75 pour mesurer le taux de C peptide humain (produit du clivage de la proinsuline, indicateur de la fonction des îlots). Pour valider notre modèle, nous avons ensuite évalué 8 préparations greffées chez 4 patients diabétiques. A chaque fois 1% des îlots destinés au patient ont été transplantés sur une souris immuno-incompétente. Une analyse de corrélation a été effectuée entre le taux de C peptide chez la souris et le taux de C peptide du patient. Enfin, pour tester les capacités d'optimisation de la fonction des îlots in-vivo de la Simavastatine, 4 souris ont été greffées avec 2000 IEQ provenant du même pancréas et reçu ou non de la Simvastatine (2mg/kg/j dans l'eau du biberon). Résultats : Lors de la mise au point de notre modèle, nous avons observé chez les souris, une corrélation entre le taux de C peptide et le nombre d'îlots greffés (p<0,05). Lors de l'évaluation des greffes cliniques, l'évolution du taux de C peptide chez le patient était corrélée avec la mesure du taux de C peptide humain chez la souris à J15, à J30 et à l'aire sous la courbe formée par le taux de C peptide de chaque souris entre J0 et J60 (p<0,05). Lors de l'utilisation de la Simvastatine, l'aire sous la courbe des taux de C peptide était augmenté de 74% lorsque les souris étaient traitées à la Simvastatine. Ces résultats préliminaires doivent être confirmés chez un plus grand nombre d'animaux.Notre modèle in vivo d'évaluation de la fonction des îlots greffés chez le patient semble avoir une bonne valeur prédictive. Il est possible d'utiliser ce modèle pour tester in vivo les différentes stratégies d'optimisation de la fonction des îlots greffés.

 


Expression du facteur tissulaire par les cellules exocrines pancréatiques humaines dédifférenciées (DEA 2004)

L'allogreffe d'îlots de Langerhans (IL) constitue un espoir dans le prise en charge du diabète de type 1. Cependant l'injection intra portale des îlots induit une activation de la coagulation et de l'inflammation, regroupées sous le terme de RIMS (Réaction Inflammatoire Médiée par le sang). Cette réaction est potentiellement dommageable pour l'efficacité métabolique des greffes par la perte de masse fonctionnelle greffée qu'elle pourrait engendrer. L'objectif de notre étude était de rechercher dans le pancréas humain et dans un modèle de dédifférenciation des cellules exocrines en cultures in vitro en cellules de phénotype canalaire, un de ces médiateurs potentiels, le Facteur Tissulaire (FT). Matériels et méthodes : L'expression de la protéine et de l'ARNm du FT a été recherchée par des techniques d'immunomarquage, de Western blot, de cytométrie en flux et de RT-PCR. L'activité pro coagulante du FT a de plus été mesurée par méthode amidolytique dans des fractions cellulaires exocrines et de phénotype canalaire. Résultats : Contrairement à l'intense expression du FT dans les IL mise en évidence par immunohistochimie, nous n'avons pas observé la présence de cette glycoprotéine dans les tissus exocrines (acini et canaux). La recherche du FT sur des cellules canalaires obtenues par dédifférenciation des cellules exocrines en culture a permis d'identifier cette protéine par western blot, par analyse en cytométrie en flux et par le dosage des activités pro coagulantes du FT. L'expression de l'ARNm du FT a été retrouvée dès les premiers jours de culture. Toutefois, les immunocytochimies réalisées sur ces cellules n'ont pas confirmé visuellement cette expression. Conclusion : Sous réserve de la confirmation sur un plus grand nombre d'échantillon, il apparaît que dans notre modèle de dédifférenciation des cellules exocrines pancréatiques humaines, les cellules de phénotype canalaire expriment le FT. Ces cellules pourraient donc participer directement à la RIMS lors des allogreffes de tissu pancréatique.

 


Thérapie cellulaire du diabète : évaluation in vivo de la sécrétion d'insuline après autogreffe d'îlots chez le porc pancreatectomisé (thèse de vétérinaire 2003)


Après avoir fait le point sur la physiopathologie et l’état de l’art de la prise en charge du diabète sucré, l’auteur présente les avancées de la thérapie cellulaire du diabète de type 1 qui constitue l’une des voies thérapeutiques les plus prometteuses de la maladie. Il rapporte ensuite les résultats de son étude expérimentale axée sur l’évaluation in vivo de la sécrétion d’insuline après autogreffe d’îlots chez le Porc pancréatectomisé. Grâce à ce modèle, l’auteur a pu montrer la corrélation entre la réponse insulinique aiguë (A.I.R.) chez l’animal sain et la quantité d’îlots évalués après isolement. Il a également démontré la corrélation entre l’A.I.R. obtenue après la greffe et la quantité d’îlots greffés. Enfin, il a établi le caractère prédictif précoce, avant même la normalisation glycémique, de l’A.I.R. sur le résultat de la greffe. Ce modèle sera utilisable pour évaluer les nouvelles stratégies destinées à optimiser la survie et la fonction des îlots greffés chez le receveur.


Mécanismes de prolifération/différenciation des cellules b humaines (thèse de science 2003)


Notre projet de recherche porte sur la compréhension des mécanismes de prolifération/différenciation des cellules b insulino-sécrétrices afin de mettre au point des moyens de production massive de cellules b fonctionnelles. La prolifération de ces cellules matures s'accompagne d'une dédifférenciation menant à la perte d'expression de certains gènes spécifiques comme celui de l'insuline et donnant donc essentiellement des cellules b non fonctionnelles. Nous nous proposons d'étudier l'expression différentielle des gènes au cours de la dédifférenciation par des méthodes spécifiques et par identification sur une puce commerciale. Cette étude systématique a pour but de caractériser les gènes qui contribuent au fonctionnement normal de la cellule b et donc d'identifier les cibles à moduler pour redifférencier les cellules produites en masse.


Dysfonctionnement des cellules b au cours du diabète de type 2 : rôle de la glucotoxicité et de la lipotoxicité et influence du Peroxisome Proliferator-Activated Receptor g (thèse de science 2003)

Le diabète de type 2 est un syndrome hétérogène dans lequel sont impliqués à la fois une résistance à l’insuline des tissus périphériques et des défauts de la sécrétion d’insuline par les cellules b des îlots de Langerhans pancréatiques. Les thiazolidinediones, antidiabétiques oraux connus pour améliorer la sensibilité à l’insuline des tissus périphériques chez le sujet diabétique de type 2, semblent aussi avoir un effet bénéfique sur la fonction des cellules b de ces patients. Plusieurs études suggèrent que les thiazolidinediones pourraient agir à ce niveau en s’opposant au phénomène de lipotoxicité exercé par les acides gras non-estérifiés sur les îlots de Langerhans, sans permettre d’établir s’il s’agit d’un effet direct sur la cellule b ou d’une simple conséquence de la réduction des taux de lipides plasmatiques. Le Peroxisome Proliferator-Activated Receptor g (PPARg) étant le médiateur de l’effet pharmacologique des thiazolidinediones, la démonstration de son expression dans les îlots pancréatiques humains était indispensable au maintien de l’hypothèse d’un effet direct des thiazolidinediones sur la sécrétion d’insuline. Nous avons montré dans une première partie l’expression de l’ARNm et de la protéine PPARg dans les îlots par RT-PCR et western-blot. L’immunohistochimie a démontré que ce récepteur nucléaire était exprimé indifféremment dans les cellules a, b et d des îlots. La seconde partie de notre travail a été consacrée à la mise au point d’un modèle in vitro de gluco / lipotoxicité sur les îlots de Langerhans humains, afin de pouvoir évaluer l’influence des agonistes du PPARg sur ces phénomènes. Dans ce modèle, des concentrations chroniquement élevées de glucose ou d’acides gras non-estérifiés ont séparément entraîné la perte de sécrétion d’insuline stimulée par le glucose et la réduction du contenu en insuline des îlots, anomalies observées dans le diabète de type 2.
L’expression de différents gènes impliqués dans les métabolismes glucidique et lipidique a aussi été modifiée dans ces conditions. Ce modèle doit permettre l’évaluation in vitro de candidats médicaments visant les anomalies fonctionnelles des cellules b, et en particulier des agonistes PPARg sélectifs.


 

Activation de la coagulation majeure après injection intraportale d'îlots de langerhans (DEA 2001-2002-2003)


Avec l'amélioration des protocoles d’immunosuppression, le concept de la thérapie cellulaire dans le traitement du diabète de type I est aujourd'hui validé. Son application clinique se heurte encore à la médiocre fonction initiale des îlots et à la nécessité de greffer les îlots de plusieurs donneurs pour un même receveur. Une intense activation de la coagulation et de l’inflammation, par les îlots placés au contact du sang allogénique, ont été mises en évidence in vitro. Cette réaction non spécifique pourrait contribuer à la non fonction primaire des îlots implantés dans la veine porte et favoriser la réaction allogénique ultérieure. Au cours d’études préalables chez le porc et l’homme, nous avons confirmé l’existence de cette réaction in vivo et précisé ses caractéristiques. L’injection intraportale d’îlots de Langerhans induit une activation de la coagulation majeure et immédiate étroitement corrélée à la nature et au volume des cellules administrées. L’administration d’héparine, couramment utilisée en clinique, ne prévient que partiellement cette réaction. Les résultats d'une étude en cours montrent l'intérêt de l'antithrombine recombinante humaine (ATrh) à haute dose pour la prévention de cette réaction thrombotique et l‘activation secondaire de l’inflammation, au prix d’un risque hémorragique acceptable. Le premier objectif de ce projet est de confirmer l'intérêt de ce traitement pour augmenter la masse d’îlots fonctionnelle à un mois dans un modèle d'autogreffe chez le porc pancréatectomisé. En fonction des résultats de cette étude, l’application clinique de ce traitement pourrait être envisagée en permettant en particulier d’optimiser les résultats de la greffe afin de n’utiliser qu’un seul donneur par receveur.

Nous cherchons à préciser les mécanismes responsables de cette activation initiale de la coagulation. Nous étudions d'abord son caractère spécifique en comparant chez le porc l'activation de la coagulation après injection intraportale de préparations d'îlots pancréatiques autologues, allogéniques et xénogéniques. Puis nous étudions le rôle du facteur tissulaire, initiateur de la coagulation dont la présence dans le pancréas n'est pas connue mais expliquerait les résultats des études préalables. Nous cherchons à confirmer sa localisation au sein des différents tissus pancréatiques, puis son rôle en l'inhibant avec un anticorps anti-facteur tissulaire humain et le TFPI (Tissue Factor Pathway Inhibitor).


Transdifférenciationin vitro du tissu pancréatique exocrine humain (thèse de science 2000)


Parallèlement à ces études consacrées à la greffe d’îlots de Langerhans, nos travaux sur la culture des îlots humains et l’intérêt tout particulier des membres cliniciens de l’équipe pour les tumeurs endocrines du pancréas, nous ont conduit à nous intéresser aux cellules souches du pancréas. Grâce à l’utilisation de matrices de collagène, nous avons d’abord reproduit chez l’homme la néoformation in vitro de cellules épithéliales canalaires et leur prolifération à partir de préparations d’îlots, identiques à celles observées in vivo pendant la régénération pancréatiques. Nous avons ensuite décrit et quantifié l’obtention de cellules de phénotype canalaire à partir des fractions non endocrines, les plus abondantes du pancréas, confirmant la possibilité d’une transdifférenciation des cellules exocrines humaines. Plus récemment nous avons caractérisé ce phénomène au niveau protéique et transcriptionnel et démontré la réexpression au sein de ces cellules canalaires néoformées de IPF1/PDX1, un facteur de transcription homéodomaine essentiel pour le développement du pancréas et impliqué chez le rongeur dans la différenciation des cellules souches pancréatiques. Ces résultats suggèrent la capacité de prolifération et de différenciation endocrine des cellules canalaires humaines obtenues par transdifférenciation, ouvrant d’importantes perspectives.

La différenciation in vitro des cellules épithéliales canalaires pancréatiques, considérées comme les cellules souches du pancréas, pourrait être une nouvelle source importante de cellules b pour le traitement du diabète.
Afin d’étayer cette hypothèse, nous avons isolé des cellules de phénotype canalaire pancréatique. Nous avons comparé la méthode classique d’isolement des cellules canalaires humaines à partir du canal de Wirsung, le canal pancréatique principal, soit par culture, soit après digestion enzymatique avec 2 méthodes indirectes: à partir d’îlots humain mis en culture tridimensionnelle en collagène et à partir de culture de tissu exocrine en monocouche par transdifférenciation.
Un nombre limité de cellules canalaires viables a été obtenu du canal principal. La dissociation des structures kystiques formées à partir des préparations d’îlots cultivées en CQR a permis d’obtenir des cultures de phénotype canalaire. La plus grande quantité de cellules a cependant été obtenue à partir du tissu exocrine en culture. Considérant la viabilité, l’extrapolation à un pancréas humain entier, cette dernière voie d’obtention permet d’obtenir 1696 ± 526x106 cellules de phénotype canalaire.
Nous avons ensuite montré dans les premiers jours de culture, durant la perte du phénotype exocrine et l’augmentation des marqueurs canalaires, une expression augmentée de la protéine et des ARNm de IPF1 (Insulin Promoter Factor 1), respectivement de 3,2 fois et 10,5 fois (n=5, P<0,001 vs jour 1). Ce facteur de transcription est une protéine homéodomaine qui régule l’ontogenèse pancréatique et l’expression de plusieurs gènes spécifiques des cellules b chez l’adulte. Les études immunohistochimiques, de prolifération et d’apoptose ont confirmé la capacité de transdifférenciation des cellules acineuses.
En conclusion, nous décrivons un moyen d’obtenir in vitro, une source abondante de cellules ayant un phénotype épithélial canalaire, considérées comme les cellules souches du pancréas.


Viabilité et fonctionnalité des cellules b après isolement (DEA 1999)


Dans le cadre d'un programme de recherche sur la greffe d'Îlots de Langerhans, développé dans notre laboratoire, une étape déterminante dans le succés de la greffe est le contrôle de la qualité du greffon qui a pu être endommagé au cours de l'isolement. Il est évidemment primordial de s'assurer du maintien de la viabilité et de la fonctionnalité des cellules b qui sécrétent l'insuline avant de les greffer. D'autre part, l'obtention de cellules b isolées du reste des cellules composant l'Îlot est un préalable à toute étude physiopathologique.
Dans ce souci, nous nous sommes attachés à mettre au point une méthode simple et rapide de caractérisation des cellules b. Nous avons pour cela mis à profit la richesse particulière en zinc de ces cellules pour les marquer par une sonde fluorescente, Newport Green, dont nous avons montré la capacité à discerner les cellules b des autres cellules pancréatiques. L'étude approfondie de cette sonde a également mis en évidence que le marquage était spécifique des cellules vivantes et non toxique.
Dés lors, il apparaÎt possible d'utiliser ce marquage pour isoler, par cytométrie en flux, des cellules b fonctionnelles dont la purification est nécessaire à l'étude spécifique de cette population. De plus, un tel marquage appliqué aux préparations d'Îlots à greffer, rendant compte de la pureté en cellules b et de leur viabilité, présente l'avantage par rapport aux techniques d'évaluation actuelles, de témoigner véritablement de la capacité de ces préparations à sécréter l'insuline.


 

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